指南·规范·共识 核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识
中国人民解放军总医院第八医学中心结核病医学部,《中国防痨杂志》编辑委员会,中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会
核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术在结核病与非结核分枝杆菌病病原学和耐药性诊断中的应用越来越多,为早期诊断、鉴别诊断和耐药鉴定提供了快速、准确的依据。然而,在实际应用中,临床医生对标本的选择、留取、送检时机及注意事项、报告结果的解读等的理解和掌握参差不齐,尚需规范化。本共识总结了核酸MALDI-TOF MS检测技术应用于结核病和非结核分枝杆菌病诊断的临床适应证和标本采集注意事项,介绍了如何正确解读核酸MALDI-TOF MS技术鉴定分枝杆菌菌种和耐药性的报告结果,以进一步规范核酸MALDI-TOF MS技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用,提高临床诊断水平,指导临床开展早期精准有效的治疗。
结核病是严重威胁人类健康的重要传染性疾病之一。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)估计,2021年全球有1060万例新发结核病患者,死亡近160万例,新增45万例耐多药/利福平耐药结核病患者。其中,我国新发78万例结核病患者,新增耐多药/利福平耐药结核病患者约3.3万例,是全球结核病及耐药结核病高负担国家之一；肺外结核占所有结核病的15%～40%,因其容易导致器官或组织功能性损伤和器质性障碍而成为近年来结核病领域关注的重点；全球由非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)引起的疾病比例呈现上升趋势,在很多发达国家,NTM病甚至超过了结核病。我国的NTM分离率也逐年增高,南方和沿海地区高于北方和内陆地区。宿主及环境因素对NTM病的流行也有很大影响。临床上以NTM肺病最为常见,NTM肺病的临床表现、放射影像学特征和痰涂片抗酸杆菌染色检查特征与肺结核极其相似,且大多数NTM对常用抗结核药物呈天然耐药或耐药率高,需要经过数月至数年的漫长复杂的治疗,有时因不能耐受药物的不良反应,导致治疗不完全或再感染而复发,对人类健康构成重大威胁,已成为全球关注的公共卫生健康问题。因此,准确快速诊断和鉴别诊断结核病与NTM病及其耐药性,对指导临床开展早期精准有效治疗至关重要。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术是一种直接分析大分子的质谱技术。来自生物样本的核酸、蛋白质、脂质等提取物与基质混合后置于合成金属板孔的芯片中,使得样本在基质中被晶体化。将该金属板芯片放入质谱仪中,氮气激光的短脉冲将在此轰击金属板,吸收能量后的基质将导致生物样本解离、蒸发并在气象阶段离子化。离子化分子在静电场中加速,喷射通过真空的金属飞行管直到抵达检测器,离子化分子的飞行速度取决于质荷比,其中相对分子质量小的离子抵达时间短于相对分子质量大的离子。基于以上原理,样本解离的离子根据其飞行时间而被分开,产生一系列由不同强度的质荷比峰组成的质谱结果,且每个样本产生一个质谱。
1996年,第一个MALDI-TOF MS试验成功鉴定出细菌。自2010年以来,逐渐应用于临床微生物检测领域,在分枝杆菌领域也有应用,但是绝大多数应用都是基于蛋白质的相对分子质量差异,而非基因序列多态性。基于蛋白质的MALDI-TOF MS技术需要进行分枝杆菌培养,无法达到快速诊断的目的,因此,基于基因序列多态性的核酸MALDI-TOF MS技术应运而生。
核酸MALDI-TOF MS技术是以核酸作为细菌鉴定的生物标志物,基本原理是通过对多靶点基因片段进行多重PCR特异性扩增,去除脱氧核糖核苷酸后,进行各个位点的单碱基延伸反应,经处理后的延伸反应产物同质谱所需基质混合,放入飞行时间质谱仪中运行,每份样本会得到独特的指纹质谱图,经过判读后获得菌种及耐药信息。
核酸MALDI-TOF MS技术可以同时针对分枝杆菌的保守基因片段,例如16S rRNA、hsp65等基因的多态性进行设计,从而快速鉴定分枝杆菌菌种。同时,根据耐药相关的基因多态性进行设计,获得rpoB、katG、gyrA、erm(41)等分枝杆菌相关的耐药基因突变结果。常见的基于核酸扩增技术的结核分枝杆菌检测均基于IS6110、IS1081等位点进行扩增,选择其中的1个或2个,而核酸MALDI-TOF MS技术可以在此基础上考虑增加其他位点的多态性检测,例如内转录间隔区(internal transcribed space,ITS)、rpoB等基因,因此鉴定分枝杆菌的敏感度更高；而且由于有多基因结果的验证,可以在提高敏感度的同时,保证结核分枝杆菌检测的特异度。同时,在耐药性检测方面应用范围更广,几乎覆盖了目前常用的抗结核和抗NTM病的药物,检测针对性强、准确性高。在飞行时间质谱仪检测的过程中,从激光发射到信号接收检测只需几毫秒,因此在短时间内对数百例样本同时进行检测分析,具有高通量、快速、灵敏、高分辨率、低成本等特点,且不依赖于荧光探针等荧光类试剂,检测周期短于一代和二代测序,对少量样本也能进行多基因多位点检测。通过提取生物样本中的核酸分子继而进行特异性扩增,实现单个核苷酸碱基的直接鉴定,无需培养,实现快速诊断,可以满足临床早期诊断并指导治疗的需求。表1简要概括总结了常用分枝杆菌病原学及其耐药性鉴定的分子诊断方法的优劣势。
已有研究证实,核酸MALDI-TOF MS技术鉴定分枝杆菌及其耐药性具有较高的准确性。2017年,来自中国的研究团队将此技术应用于鉴定结核分枝杆菌复合群和NTM,结果表明该技术的检测限为5个拷贝数,同时检测耐药的敏感度和特异度都达到了较高水平。有文献报道,通过对168株临床结核分枝杆菌分离株进行抗结核药物的耐药性分析,发现核酸MALDI-TOF MS技术检测结核分枝杆菌耐药性有很好的表现,大部分药物的检测结果与表型药物敏感性(简称“药敏”)试验结果具有很好的一致性。针对复治结核病患者的结核分枝杆菌耐药性检测研究显示,核酸MALDI-TOF MS技术与液体培养药敏检测具有很好的一致性；针对涂阴或无痰肺结核患者的支气管肺泡灌洗液样本的检测结果显示,核酸MALDI-TOF MS技术的敏感度和曲线下面积(area under curve,AUC)均优于GeneXpert MTB/RIF和培养法。来自西安市胸科医院的一篇研究报道,相比于高分辨率熔解曲线方法(high-resolution melting curve,HRM),核酸MALDI-TOF MS技术表现出更高的准确性。
核酸MALDI-TOF MS技术检测分枝杆菌及其耐药性具有较好的诊断价值和临床应用前景。为了规范核酸MALDI-TOF MS技术在分枝杆菌病诊断中的应用,结合中国临床证据及专家实践,在借鉴国际研究证据的基础上,解放军总医院第八医学中心、《中国防痨杂志》编辑委员会和中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会基础和临床学术部联合组织专家共同拟定《核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识》,供临床医生在临床诊疗时参考,并为将来进一步制定临床相关指南提供基础。
2022年3月,解放军总医院第八医学中心结核病医学部和《中国防痨杂志》编辑委员会依托中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会基础和临床学部组建《核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识》专家组。专家组成员必须满足以下条件:(1)担任中国防痨协会专业分会或中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会委员或《中国防痨杂志》编委、通信编委；(2)具有高级专业技术职称；(3)从事结核病临床、检验和基础研究工作10年以上,具有丰富的相关工作经验,在结核病领域有较高的学术地位；(4)自愿参加专家组,能够全程参加专家共识的讨论与制定,并积极提出自己的意见和建议。专家组成员来自全国结核病专业诊疗机构,历时1年时间,对国内外核酸MALDI-TOF MS技术在结核病和NTM病诊断中的临床应用及进展进行了文献检索和复习,并对国内各地相关临床问题及应用经验进行了深入调查和相互沟通。虽然核酸MALDI-TOF MS技术作为一项新型技术在结核病和NTM病诊断中的临床应用研究较少,专家组多次召开专家讨论会,经过认真分析,反复论证,归纳总结,一致认为核酸MALDI-TOF MS技术在分枝杆菌菌种鉴定和耐药性快速检测方面具有较好的临床诊断价值和应用前景,最终达成一致意见,形成共识终稿。
目前,核酸MALDI-TOF MS技术可鉴定结核分枝杆菌复合群8个亚种和40个NTM菌种及其亚种,合计48个分枝杆菌菌种和亚种(表2),几乎覆盖了临床上分枝杆菌病的所有常见致病菌,可以满足临床实现快速鉴定分枝杆菌菌种的要求,为临床医务人员提供诊断参考。另外,随着临床实践的逐步积累,核酸MALDI-TOF MS技术可根据临床上未来可能出现的菌种予以增加鉴定。
根据WHO 2018年和2021年发布的耐药位点证据等级和我国发表的高质量文献,目前核酸MALDI-TOF MS技术可检测结核分枝杆菌4种一线抗结核药物(异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇)和常用的二线抗结核药物(氟喹诺酮类、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、对氨基水杨酸钠、环丝氨酸、氯法齐明、贝达喹啉、利奈唑胺)的耐药基因型；并可检测NTM大环内酯类和氨基糖苷类药物的耐药基因型,了解其耐药性(表3,4)。
基因突变一般包括错义突变、同义突变和无义突变3种类型,核酸MALDI-TOF MS技术除可检测上述的错义突变外,目前还可检测到的结核分枝杆菌常见同义突变如表5所示。
对可疑肺结核、肺外结核和NTM病患者的快速诊断和鉴别诊断,以及确诊结核病、NTM病但治疗效果不理想患者的药敏检测,应尽早送核酸MALDI-TOF MS检测。见图1。
推荐意见1:近期具有明确的肺结核密切接触史,咳嗽、咳痰超过2周,伴或不伴有咯血、胸痛、胸闷、气短等呼吸道症状和低热、盗汗、乏力、体质量减轻等全身中毒症状,临床常用结核病病原学检查结果为阴性,影像学检查存在肺部病变,需快速确诊的患者,建议送痰和支气管肺泡灌洗液进行培养的同时送核酸MALDI-TOF MS检测,可在1～2d内快速鉴定病原菌以明确诊断。
推荐意见3:疑似结核性胸膜炎患者,胸腔积液常规结核分枝杆菌细菌学检查阳性率低,建议按要求送胸腔积液进行核酸MALDI-TOF MS检测以提高病原学检出率。
推荐意见4:疑似肺外结核,如结核性脑膜炎、结核性淋巴结炎、骨关节结核、肠结核、结核性腹膜炎、泌尿生殖系统结核、结核性心包炎、皮肤结核等肺外结核患者,治疗效果差,分泌物和(或)活检、手术组织临床常用病原学检测阴性时,适合送核酸MALDI-TOF MS检测。
推荐意见5:影像学表现高度疑似NTM肺病,尤其是IGRA阴性和EC皮肤试验阴性,TST阳性者,适合及早送痰和(或)支气管肺泡灌洗液进行核酸MALDI-TOF MS检。