最新研究表明对免疫细胞的适当调节，有助于理解其代谢途径及代谢异常时引发免疫功能紊乱和疾病发展的机制。当前，这种理解还受限于对免疫细胞群的分析。单细胞应用技术，可评估临床样本中单个免疫细胞的代谢状态，有...
最新研究表明对免疫细胞的适当调节，有助于理解其代谢途径及代谢异常时引发免疫功能紊乱和疾病发展的机制。当前，这种理解还受限于对免疫细胞群的分析。单细胞应用技术，可评估临床样本中单个免疫细胞的代谢状态，有助于推动免疫代谢领域的发展和提高疾病诊断能力。2020年10月Artyomov等人在《Cell Metabolism》杂志上发表了一篇名为“Immunometabolism in the Single-Cell Era”的综述，回顾了单细胞应用技术及其验证免疫代谢的通用原则，概述了免疫细胞的代谢异质性，并讨论了当前免疫技术的局限性及未来的探索方向，现介绍如下：
新陈代谢是生物过程的核心。研究表明，免疫细胞的代谢途径与特定免疫功能与健康或疾病下的细胞状态密切相关。癌症和慢性炎症代谢性疾病的发生与机体核心代谢途径的失调有关，但基于疾病的复杂性和细胞表型的多样性，目前对致病环境中的免疫代谢重塑尚缺乏整体理解。
机体的营养水平、氧气供应量等改变和信号分子及邻近细胞的相互作用均可诱导代谢发生改变。细胞微环境的独特性使体内细胞在新陈代谢、细胞表型和免疫功能上均不完全相同。在单细胞分辨率下，解决免疫代谢的时空异质性并阐明机理将有助于推动免疫代谢领域的不断发展。单细胞图谱分析技术有助于帮助理解细胞代谢与免疫调节和疾病进展的机制，能阐明免疫细胞代谢转化为效应表型的轨迹。
细胞外通量分析仪如Seahorse apparatus，通过动态记录细胞外酸化率(ECAR) 和耗氧率(OCR)可提供糖酵解和线粒体呼吸相关的核心数据。应用特定底物和可探究细胞对葡萄糖、谷氨酰胺或脂肪酸的相对偏好。目前的Seahorse 分析技术可简单、快速地以96孔方式对细胞进行分析，极大扩展了免疫代谢的研究视野，但该技术无法提供有关糖酵解和线粒体内三羧酸循环（TCA循环）以外代谢途径的详细信息。应用Seahorse 分析，有学者发现炎症巨噬细胞中的糖酵解开关与线粒体功能障碍、效应T细胞和活化树突状细胞(DCs)糖酵解的增加及记忆性T细胞和IL-4活化巨噬细胞的线粒体呼吸增强有关。ECAR是糖酵解的替代标记，但培养基酸化不一定是糖酵解增强的结果，线粒体生成的二氧化碳或细胞外TCA循环代谢中间物也可使培养基酸化。
在特定时间点，代谢组学通过液相或气相色谱-质谱(LC-MS或GC-MS)可测量一系列代谢物的稳态浓度。非靶向代谢组学测量生物样本中的数百种代谢物，而靶向代谢组学则可预先评估代谢物并提供更具灵敏度的数据，以实现对代谢物浓度的精确定量。基于MS的方法需要较高的输入通量(一般为10万个细胞)，最新研究提出的单细胞分辨率空间测量代谢物的技术方法，把单细胞技术与基质辅助激光解吸电离(MALDI)-质谱成像和二次离子质谱(SIMS)相结合，有助于探索体内组织微环境中单细胞的免疫代谢过程。
特定代谢途径的通量变化与该途径内特定时间点测定的代谢物浓度不一定直接相关。通过靶向质谱在连续时间点对底物和同位素13C或15N测量，可明确代谢通量和代谢途径动力学。单细胞代谢谱分析技术针对不同代谢蛋白可提供一些免疫代谢信息。
免疫活化是糖酵解通量增加的耗能过程，此过程中机体利用葡萄糖转运体摄取葡萄糖(如GLUT1)后转化为丙酮酸，将NAD+还原为NADH并生成ATP。糖酵解酶如己糖激酶1和2 (HK1和HK2)、醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶和丙酮酸激酶同工酶M2 (PKM2)均可抑制细胞免疫功能。在无氧状态下，细胞通过乳酸脱氢酶(LDH)将丙酮酸还原为乳酸以维持糖酵解通量。Seahorse 分析中，质子和糖酵解衍生的乳酸可通过单羧酸转运体MCT1从细胞中输出时，这种发酵反应称为ECAR。糖酵解在炎症免疫效应细胞中最为活跃，对多种免疫细胞的活化模式至关重要且糖酵解率在B淋巴细胞和T淋巴细胞之间表现不同。
磷酸戊糖途径（PPP）是机体利用葡萄糖直接氧化脱氢脱羧生成NADPH及中间产物为其他物质合成提供原料的过程，G6P脱氢酶为该途径限速酶，生成的NADPH在免疫细胞中有多种生物学效应。中性粒细胞和炎症巨噬细胞可利用PPP及NADPH产生活性氧(ROS)发挥抗感染作用。NADPH还可作为抗氧化剂防止组织细胞的过度损伤。
TCA循环和线粒体电子传递链(ETC)生成的能量对机体代谢至关重要。与糖酵解相比，OXPHOS生成能量更有效且与体内免疫细胞的寿命有关。在巨噬细胞促炎活化过程中，TCA循环通过下调IDH和SDH活性而被重构，后者通过活化髓细胞中ACOD1/IRG1产生特异性免疫调节代谢物衣康酸直接抑制而实现。
脂肪酸氧化(FAO)是肉碱棕榈酰转移酶1和2 (CPT1和CPT2)将长链脂肪酸转运到线粒体基质后经羟酰基辅酶a氧化为乙酰辅酶a、NADH和FADH2并生成能量的过程。高浓度的CPT1依托莫西实验表明FAO在IL-4诱导的巨噬细胞、记忆性T细胞和调节性T细胞（Tregs）中尤为重要。然而，最近对CPT1和CPT2应用细胞特异性基因敲除的文献报道表明，FAO在此过程中很少。
与FAO相反，FAS是乙酰辅酶a羧化酶(ACC)将乙酰辅酶a羧化为丙二酰辅酶a，后脂肪酸合酶(FASN)将丙二酰辅酶a延长为脂质的合成过程。FAS支持效应T细胞增殖，是配置巨噬细胞炎症信号的质膜的关键，也是促进活化的DCs分泌细胞因子的关键。
T细胞免疫活化与氨基酸代谢需求增加相关，如Ⅰ型氨基酸转运蛋白1 (LAT1、CD98和SLC7A5)及TCR对信号转导的丝氨酸途径尤为重要。氨基酸在调节免疫反应的特定方向也发挥一定作用，如Th1和Th17细胞通过转运蛋白ASCT2可增加谷氨酰胺用量应对抗原刺激，抗炎Treg则不受谷氨酰胺供应改变的影响。谷氨酰胺酶(GLS)将谷氨酰胺转化为谷氨酸为TCA循环提供燃料，该途径可促进Th17分化，同时降低Th1和细胞毒性T淋巴细胞的分化程度。
氨基酸在炎性巨噬细胞中也有重要的调节功能。谷氨酰胺代谢与抗炎极化有关，丝氨酸代谢与IL-1b的产生有关。此外，氨基酸可促使巨噬细胞产生效应分子。LPS(+IFNγ)诱导的巨噬细胞主要通过诱导NO合成酶(iNOS)将精氨酸转化为一氧化氮(NO)，IL-4诱导的巨噬细胞则主要将精氨酸代谢为鸟氨酸和多胺。
鉴于组织微环境的重要性，实验室体外培养的细胞免疫代谢途径明显不同于体内细胞。在小鼠中应用13C-葡萄糖输注方法研究CD8+T细胞对李斯特菌感染的代谢，发现体内活化的T细胞代谢状态与体外培养的细胞不同，体外培养的T细胞在活化过程中，CD8+T细胞从OXPHOS途径向糖酵解转变，体内活化的CD8+T细胞则显示出更高的耗氧率并依靠葡萄糖依赖的丝氨酸生物合成过程。由于动物模型有其自身局限性且不能完全复制免疫学和生物学特征，因此将体外培养细胞的免疫细胞代谢技术引用到中的转换尤为重要。
免疫细胞代谢依赖于营养物质的供给，营养物质的供应因细胞在肿瘤或炎症部位微环境中的位置不同而有差别。在单细胞分辨率下了解细胞代谢状态可解释体内复杂组织微环境中免疫细胞表型异质性的分子机制，有助于解释其在病理环境下不能正常发挥功能的原因。最近的转录和成像技术可解决单细胞甚至其代谢物的空间排列问题，该技术的进步对了解样本和体内环境中的免疫代谢重构至关重要。时空异质性是免疫代谢领域常被忽视的问题。多数免疫细胞在活化后糖酵解迅速增强使代谢通量增加。理解免疫代谢的时空异质性不仅有助于更新基础生物学知识，也有助于设计新的合理的治疗方法。
免疫代谢研究中，常用的（bulk）分析技术的局限性可解释从体外到体内转化和从动物到的验证难题。代谢组学和细胞外通量分析需要较高的细胞数量，在人类临床样本中通常难以实现。如Seahorse 分析XF分析仪测量每孔中数万到数十万个细胞的细胞外通量时只需4-5个复制孔。对于代谢组学，则通常需要测量复制的50万个混合细胞，通过此技术获得的代谢信息有限。细胞外通量分析和传统代谢组学的另一缺点是其评估的代谢特征具有不稳定性，结果受分析时长和荧光活化的细胞分选仪影响。因此，需要新的代谢谱分析方法及新的、优化的细胞分离方法来测量体外特殊免疫细胞的稳定代谢特征。
代谢组学与转录组学和蛋白质组学等技术相结合，可部分解决代谢物水平不稳定性难题。代谢通量可视为代谢物水平和代谢酶活性的结果。转录组学和蛋白质组学可为代谢途径的调控提供一些见解，当与代谢组学数据整合时变得更加强大。利用网络整合方法，结合代谢组学和转录组学数据已证明含脂巨噬细胞中PPP与炎症反应程度有关。蛋白质组学和代谢组学的整合则揭示了T细胞活化的代谢需求。
目前单细胞代谢组学的大规模应用还为时过早，免疫代谢研究进入单细胞时代还需要寻找新的方法。先前使用群细胞转录组学和蛋白质组学描述细胞代谢的成功表明，单细胞组学技术将是未来的探索方向。
单细胞RNA测序(scRNA-seq)的出现使得在复杂的多细胞生态系统中解析单个细胞转录谱成为可能。应用10x基因组学管道，scRNA-seq实验每样本中多达1万个细胞，可常规检测每个细胞2到4千个基因。即使在免疫学背景下直接检测scRNA-seq数据，也可发现在体内的核心代谢过程。
细胞群转录分析可提供细胞序列在转录水平内的详尽信息。细胞信号的缺失通常意味着相应转录本的缺失。转录谱分析优势在scRNA-seq数据中并不显著。每个细胞25000-50000次读取的常规测序深度，可检测3000-4000个基因。浅层测序(即检测每个细胞大约1000个基因)能发现大多数普通和管家基因。然而，即使每个细胞检测出3000 - 4000个基因，也明显低于基于RNA-seq技术纯化的细胞群中的12000-15000个基因表达提供的信息丰富。此种情况下，须使用数据归因等技术对数据进行后处理而获得稳定的转录谱。在相同的scRNA-seq数据集中，不同细胞群每个细胞RNA的含量不同使得不同细胞间信息覆盖不均匀。用于scRNA-seq数据代谢分析的方法可大致分为两大类:(1)基于路径的分析方法；(2)基于通量平衡分析(FBA)的方法。
使用标准生物技术直接作为基因集进行探测信息途径富集技术可对构成不同代谢途径的基因进行很好的注释，如根据已发表的大量RNA-seq数据库中对该途径转录富集的初步观察，研究了T细胞中丝氨酸代谢的作用。
FBA是一种计算系统中代谢通量稳态分布的方法。简单地说，FBA将细胞内的代谢视为一个输入输出水龙头数量有限的管道系统，要求系统的每个节点都建立稳态平衡。单个酶的特异性表达水平并不直接参与建模，透视图的结果主要依赖于网络拓扑结构和模型的输入和输出。输入通常是最常见的底物摄取反应(如葡萄糖，谷氨酰胺)，输出(通常称为目标函数)与被研究的特定细胞行为相关。
基于FBA方法的优势在于其依赖于网络分析，而不与预先定义的通路知识相关联，这可揭示新的生物学概念以了解随着网络拓扑结构的变化而发生的代谢通量变化。此前，大量数据采用此法揭示了衣康酸作为SDH的作用。最近，该方法被引入到scRNA-seq数据中，以研究致病性/非致病性Th17细胞的代谢差异及与Tregs的差异。
当前方法通常关注不同细胞群之间的差异。在这些情况下，更直接的方法是简单地进行两个种群之间的差异表达分。