中药治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）疗效确切；但目前尚无客观的中医证候疗效评价指标。本研究旨在利用代谢组学筛选与中医证候疗效相关的生物标志物。我们招募了痰热壅肺（PH）/痰湿蕴肺（PD）综合征的AECOPD患者，在常规药物治疗的基础上，用中药（清热化痰或燥湿化痰颗粒）治疗7天；在治疗前后收集临床症状和体征评分、改良版英国医学研究委员会（mMRC）呼吸问卷得分、COPD评估测试（CAT）和炎症指标的数据，包括白细胞（WBC）计数、中性粒细胞计数百分比（NEU%）和C反应蛋白（CRP），以评估治疗效果；在治疗前后收集血清样本进行代谢组学分析，以筛选不同的代谢产物。共有69名AECOPD患者入选，其中PH组和PD组分别有41名和28名患者。两组治疗后的临床症状和体征评分、CAT、mMRC、NEU%和CRP水平均低于治疗前（p0.05）。血清代谢组学分析显示，治疗前后PH组有13种差异代谢物，PD组有16种差异代谢物（p＜0.05，变量投影重要性（VIP）≥1.00）。PH组中，溶血磷脂酰胆碱（LPC）（16:0）、LPC（17:1）、LPC（18:3），LPC（18:2）和LPC（17-0）与临床症状和体征评分呈负相关（p0.05）；LPC（16:0）、LPC（17:1）、LPC（16:1）和LPC（17-0）与WBC（p0.05）和NEU%（p0.05）呈负相关；LPC（16:0）与CRP水平呈负相关。在PD组中，L-苯丙氨酸与CRP水平呈正相关（p0.05），2-甲基丁酰肉碱与临床症状和体征（p0.05）以及CAT评分（p0.05）呈正相关。DL-肉碱与临床症状及体征积分呈正相关（p0.05）。血清代谢产物可能是客观评价中医证候疗效的潜在指标；然而，本研究还需要进一步的大型对照试验来验证这些发现。
我们招募了112例AECOPD患者，根据其中医证候分为PH组（n=60）和PD组（n=52）。然而，43名患者（PH组19名，PD组24名）因个人原因在治疗后没有采集血样；因此，69名患者最终被纳入研究。中药颗粒的成分如表1所示，所有患者的基线 中药颗粒的成分
PH组患者治疗后的临床症状和体征、mMRC和CAT评分均显著低于治疗前（p0.05）。治疗后的NEU%和CRP水平显著低于治疗前（p0.05）（表3）。
符号秩检验。mMRC，改良版英国医学研究委员会呼吸问卷得分；CAT，COPD评估试验；WBC，白细胞；NEU%，中性粒细胞计数的百分比；CRP，C反应性蛋白质。3. 差异代谢产物的筛选
我们对QC样本进行主成分分析以评估数据质量。结果显示，QC样品在ESI+和ESI-模式下都很好地聚集（如图1所示），表明仪器系统稳定，分析结果具有良好的再现性。表4 PD组AECOPD患者的临床疗效评价
符号秩检验。mMRC，改良版英国医学研究委员会呼吸问卷得分；CAT，COPD评估试验；WBC，白细胞；NEU%，中性粒细胞计数的百分比；CRP，C反应性蛋白质。我们使用Compound Discover 2.1提取总共3095个ESI+模式的峰和1168个ESI-模式的峰。在去除RSD大于30%的化合物后，总共获得2438个ESI+模式的化合物和854个ESI-模式的化合物用于统计分析。在Wilcoxon符号秩检验后，我们在PH组治疗前后分别筛选了401种ESI+和和/127种ESI-模式的差异化合物，在PD组治疗前后，分别筛选了366种ESI+或162种ESI-模式差异化合物（p0.05）。
主成分分析结果显示，PH组（图2A，B）和PD组（图3A，B）治疗前后的血清样本有一定程度的分离，尽管差异不显著。PLS-DA用于筛选治疗前后的差异代谢化合物。如图2C、E和图3C、E所示，各组治疗前后血清样品分离明显。我们使用置换检验进一步验证了PLSDA模型，结果表明置换检验的Q2截距均小于零，表明PLS-DA模型是有效和可靠的，没有过拟合（图2D，F；图3D，F）。根据VIP≥1.00的标准，PH组筛选出131种差异化合物（ESI+）和37种差异产物（ESI-），而PD组在治疗前后分别有95种不同的化合物（ESI+）和36种不同的化合物（ESI-）。
通过在各种数据库中搜索和比较，在治疗前后，我们在PH组（表5）和PD组（表6）共鉴定了13种不同的代谢物。代谢产物富集结果表明，在PH组，与治疗前相比，治疗后的溶血磷脂酰胆碱（LPC）（14:0）、LPC（15:0）、LPC（16:0）和LPC（17:1），溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）（18:2）、LPC（18:3），LPC（18:2）、LPC（16:1）和LPC（17:0）的水平上调，而乙酰左旋肉碱、3-羟基辛酰基肉碱、己酰基肉碱和9-癸烯酰基肉碱的水平在治疗后比治疗前下调。在PD组中，在治疗前后的16种差异代谢产物中，治疗后LPC（14:0）和LPC（15:0）水平较低，而其他14种差异代谢产物的水平在治疗后增加（图4）。
Wilcoxon符号秩检验。RT，保留时间；VIP，变量投影重要性；LPC，溶血磷脂酰胆碱；LPE，溶血磷脂酰乙醇胺。
差异代谢产物的通路富集分析表明，PH组处理涉及的代谢主要包括极长链脂肪酸的β-氧化、支链脂肪酸的氧化、磷脂生物合成和花生四烯酸代谢（图5A）。PD组参与治疗的代谢途径为极长链脂肪酸的β-氧化、支链脂肪酸的氧化、肉碱合成、嘌呤代谢、线粒体β-长链饱和脂肪酸氧化、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、脂肪酸代谢、花生四烯酸代谢（图5B）。
Wilcoxon符号秩检验；RT，保留时间；VIP，变量投影重要性；LPC，溶血磷脂酰胆碱。
图4 差异代谢物热图。（A）PH组；（B）PD组。使用平衡log2转换和归一化数据创建热图，其中治疗前后PH组41例，PD组28例。每列代表一个样本。顶部带红线的列表示处理前的样本，顶部带绿线的列表示治疗后的样本。在随后的行中，红色表示浓度增加，蓝色表示浓度降低。颜色强度与更改的大小成比例地增加。
图5 代谢途径富集的气泡图。气泡大小表示参与该途径的差异代谢产物的数量。气泡颜色表示该代谢途径的p值。（A）PH组；（B）PD组。
随着代谢组学技术的广泛应用，提高了中医证候诊断和疗效评价的客观性和准确性，基于代谢组学的生物标志物研究成为一个热门话题。Zhang等发现，在AECOPD痰浊综合征患者中，乳酸、琥珀酸、硫辛酸、新橙皮苷、D-红鞘氨醇、葡萄糖、亚麻酸甲酯、天冬酰胺和尿素等15种物质的表达显著上调，而苏氨酸和牛磺酸的表达显著下调。另一项研究发现，AECOPD痰热壅肺证和痰湿蕴肺证患者血清中存在50种小分子差异代谢产物，涉及鞘脂、磷脂、亚油酸代谢等代谢紊乱。尽管多项研究表明，AECOPD不同中医证型患者的代谢产物与稳定期或健康人的代谢产物不同，与中医证候疗效评价相关的生物标志物研究报道较少。因此，本研究在评价中医辨证论治结合西医常规治疗的临床疗效的基础上，通过代谢组学方法对伴有PH和PD综合征的AECOPD患者血清进行了代谢组学分析，初步探索了与AECOPD中医证候疗效评价相关的生物标志。